Потрапляння на шкіру стоп-реагенту, що складається з 5% сірчаної кислоти може викликати подразнення. У такому випадку необхідно промити уражену ділянку великою кількістю води. 3,5-тетраметилбензидин, що входить до складу розчину субстрату тетраметилбензидину (ТМБ), являється потенційним канцерогеном. Всі інші компоненти Набору у використовуваних концентраціях є нетоксичними.
Певну потенційну небезпеку для лабораторного персоналу являють реактиви, які містять компоненти людського походження, а також досліджувані зразки сироваток та плазми крові, які необхідно розглядати як потенційно інфікований матеріал, який може містити віруси гепатиту, ВІЛ та інших збудників захворювань. Тому при роботі з набором необхідно використовувати одноразові рукавички.
Популярні питання та відповіді
Яку небезпеку та потенційний ризик несуть реагенти, що входять до складу ІФА набору?
Чи допустимо для розрахунку результатів аналізу використовувати калібрувальний графік, приведений в Паспорті контролю якості?
Для кожного аналізу необхідно будувати індивідуальний калібрувальний графік та обов’язково використовувати контрольну сироватку (діапазон концентрації аналіту в контрольній сироватці вказаний в Паспорті контролю якості та на етикетці флакона).
Як розрахувати результати для попередньо розведених зразків?
Якщо попереднє розведення зразків є обов’язковою стадією аналізу, наприклад, при визначені АТ-ТПО чи АТ-ТГ, коли всі досліджувані зразки стандартно розводяться в 101 раз, то корекція даних, розрахованих на калібрувальному графіку, не потрібна. Це пов’язано з тим, що калібрувальні проби та контрольна сироватка в таких наборах також попередньо розведені в 101 раз, тобто фактор розведення калібрувальних проб, контрольної сироватки та досліджуваних зразків є однаковим. Однак, якщо вміст аналіту в попередньо розведеному досліджуваному зразку виходить за верхню межу визначених за допомогою набору концентрацій, його потрібно додатково розвести, відповідно до Інструкції із застосування набору, та провести повторний аналіз. У цьому випадку отриманий результат необхідно помножити на додатковий фактор розведення.
У більшості наборів попереднього розведення досліджуваних наборів не потрібно проводити. Однак якщо виміряний вміст аналіту у досліджуваному зразку перевищує верхню межу концентрацій, що визначаються, його слід розвести, відповідно до Інструкції із застосування набору, та провести аналіз повторно. У такому випадку отриманий результат необхідно помножити на фактор розведення.
Рекомендований фактор розведення може залежати від виду досліджуваного зразка, наприклад, при визначенні концентрації ХГЧ на різних термінах вагітності. Детальна інформація приведена в Інструкціях із застосування наборів.
Як будується калібрувальний графік?
Побудова калібрувального графіка та визначення вмісту аналіту при КІЛЬКІСНОМУ визначенні дозволяється проводити вручну, з використанням лінійного чи логарифмічного масштабного паперу, а також за допомогою спеціальних комп’ютерних програм.
Що може вплинути на результати спектрофотометрії вмісту лунок?
Наявність подряпин, відбитки пальців, капель та інших забруднень на дні лунок з обох сторін планшета може змінити (іноді досить сильно) покази оптичної густини.
Вимірювання оптичної густини вмісту лунок необхідно провести не пізніше 5 хвилин після внесення стоп-реагенту. Це пов’язано з тим, що реакція окислення хромогену після внесення кислоти до кінця не зупиняється, а оптична густина розчинів в лунках продовжує зростати.
Спектрофотометрію необхідно проводити тільки при рекомендованій довжині хвилі, так як навіть незначні її зміни можуть призвести до падіння значень оптичної густини, що реєструються.
Наявність пухирців повітря в лунках планшета, які іноді з’являються після внесення стоп-реагенту в лунки, призводить до розсіювання світла та хибному завишенню оптичної густини при спектрофотометрії.
На що необхідно звернути увагу при розвитку забарвлення в лунках (стадії інкубації з розчином ТМБ)?
Необхідно притримуватися рекомендованим в Інструкції із застосування Набору показникам температури та тривалості стадії інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ).
Процес розвитку забарвлення в лунках бажано контролювати візуально. Інкубацію планшета з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) необхідно проводити у темряві, щоб уникнути крайових ефектів (більш яскравого забарвлення крайових лунок), і, як наслідок, значної дисперсії результатів.
Інкубація в термостаті дозволяє стандартизувати процес розвитку забарвлення, що важливо для отримання надійних відтворюваних результатів. Цей прийом наполегливо рекомендується використовувати, якщо температура в приміщенні схильна до значних коливань
Яких рекомендацій слід дотримуватися при відмиванні лунок?
Якість відмивання лунок дуже важлива для отримання надійних результатів. У кожному циклі відмивання лунки повинні рівномірно і практично повністю заповнюватися розчином. Після видалення розчину для відмивання у лунках не повинно залишатися залишків рідини.
Занадто довге перебування розчину для відмивання у лунках та збільшення кількості циклів відмивання може призвести до вимивання зв’язаного кон’югату та погіршення якості аналізу.
Залишки розчину для відмивання слід видалити простукуванням перевернутого планшета на листі фільтрувального паперу.
Чи можна скоротити час інкубації, якщо в приміщенні спекотно (вище +25°С)?
В такому випадку дозволено скоротити час інкубації з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) до 7-10 хв. Якщо, не дивлячись на прийняті рішення, інтенсивність забарвлення залишається надлишковою, необхідно видалити частину хромогенної суміші з усіх лунок та повторно виміряти в них оптичну густину.
Не проводьте інкубацію планшета поблизу нагрівальних приладів, так як температура в різних лунках буде відрізнятися, а зміни результатів аналізів стануть непередбачуваними.
Чи може подовження часу інкубації компенсувати вплив низької температури, якщо в приміщенні холодно (нижче +18°С)?
Спроби компенсувати вплив низької температури шляхом подовження часу інкубації не завжди бувають успішними, тому, якщо у приміщенні дуже холодно, краще проводити інкубацію в термостаті, що підтримує рекомендовану температуру, включаючи кімнатну (+18…+25°С).
Чи впливає температурний режим на результати ІФА?
При знижених температурах (нижче +18°С) всі процеси, що протікають на стадіях інкубації та ферментативного забарвлення, уповільнюються. Це призводить до зниження оптичної густини розчинів у лунках, значному погіршенню характеристик метода, а іноді і до неправильних результатів.
При високій температурі (вище +25°С) всі процеси, що протікають під час аналізу, пришвидшуються, швидкість ферментативного забарвлення збільшується, і саме тому значення оптичної густини розчинів у лунках можуть значно перевищувати 3,0 одиниці, що суттєво ускладнює облік результатів та робить його неможливим.
На що слід звернути увагу при внесенні реагентів у лунки планшету?
Для отримання точних результатів дуже важлива правильна техніка піпетування, що дозволяє звести до мінімуму випадкову помилку об’єму зразка, що вноситься. Слід надавити на поршень дозатора до другого упору, погрузити наконечник у зразок, плавно (не різко, щоб не було завихрення та розплескування зразка всередині наконечника) відібрати необхідний об’єм, зняти краплю ззовні наконечника, торкнувшись ним краю пробірки (крапля зазвичай формується при глибокому зануренні наконечника у зразок), ввести наконечник в лунку та видавити зразок до першого упору вздовж стінки лунки. При цьому необхідно, щоб наконечник торкався поверхні рідини, інакше на ньому утвориться крапля, а частина об’єму не буде додана.
Суворо дотримуйтесь рекомендованої послідовності та тривалості процедури проведення аналізу описаній в Інструкції із застосування набору.
Всі роботи по внесенню реагентів та зразків повинні проводитися максимально ритмічно та швидко, без значних перерв.
Не залишайте незаповнені реагентами лунки в перервах між стадіями аналізу чи після їх відмивання. Під час вимушеної паузи необхідно покласти планшет лунками вниз на лист вологого фільтрувального паперу .
Інтервали між внесенням та видаленням розчину при відмиванні лунок повинні бути мінімальними.
Дотримуйтесь рекомендованого режиму відмивання лунок та не допускайте мимовільного змінення об’ємів рідини, кількості циклів та послідовності відмивок.
Чи можна проводити ІФА у моноплікатах?
Проведення імуноферментного аналізу в моноплікатах часто використовується в лабораторній практиці для зниження вартості одного дослідження. Однак, це є фактором ризику отримання неправильних результатів. При аналізі калібрувальних проб, контрольної сироватки та досліджуваних зразків у моноплікатах неможливо оцінити величину розходження в паралелях та провести на їх основі визначення неправильних чи сумнівних результатів.
Калібрувальні проби завжди необхідно ставити у реплікатах, тому що випадковий «викид» однієї точки може призвести до неправильного розрахунку всіх зразків, що потрапляють до відповідної області кривої. Аналіз невідомих зразків рекомендовано також проводити в дублікатах, щоб мати можливість повторити дослідження за наявності суттєвого розкиду результатів для одного і того самого зразка.
Яка кількість реплікатів для кожного досліджуваного зразка являється оптимальною?
Для максимально повного забезпечення контролю якості лабораторних досліджень аналіз калібрувальних проб, контрольної сироватки та досліджуваних зразків рекомендуємо проводити в дублікатах.
Чи можна використовувати набори виробництва ТОВ «ХЕМА» в ІФА-аналізаторах?
Так, якщо даний прилад розрахований на проведення аналізу в стандартному 96-лунковому планшеті та має «відкрите» програмне забезпечення.
Для деяких наборів необхідно, щоб у складі аналізатора був термостатований інкубатор, що підтримує температуру +37°С±1°С. Деякі автоматичні ІФА-аналізатори не забезпечують однакову протяжність інкубації в різних лунках планшета. Це пов’язано з послідовним та недостатньо швидким внесенням реагентів набору в лунки. В такому випадку буде спостерігатися дрейф результатів, особливо помітний при аналізі великої кількості досліджуваних зразків, а також у наборах з короткою інкубацією (30 хв). Для оцінки ступеню спотворення результатів рекомендуємо розташовувати лунки з контрольною сироваткою на початку та в кінці серії аналізованих зразків.
Які вимоги пред’являють до чистоти лабораторного посуду?
Весь скляний посуд, а також ванночки для реагентів повинні бути ретельно вимиті та висушені. Зверніть увагу, що навіть залишкові забруднення синтетичними миючими засобами та окислюючими реагентами можуть позначитися на стабільності реагентів та результатах аналізу. Саме тому, посуд необхідно ретельно обполіскувати дистильованою водою.
Необхідно виділити окремий посуд (ванночки для реагентів) та, по можливості, окремі дозатори зі змінними наконечниками для роботи з кон’югатом та розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ).
Рекомендовано використовувати одноразові ванночки для реагентів та наконечники дозаторів. При надяганні наконечників на дозатор не торкайтесь кінчиками наконечників робочих поверхонь стола, лабораторного посуду, упаковки набору, рук та робочого одягу оператора.
Яке лабораторне обладнання та витратні матеріали необхідні для ручного проведення аналізу (тобто без використання автоматичних аналізаторів)?
Окрім набору реагентів для проведення аналізу в лабораторії необхідно мати спектрофотометр вертикального сканування (рідер), який дозволяє вимірювати оптичну густину розчинів в лунках при довжині хвилі 450 нм та 620-680 нм в діапазоні від 0 до 3,0 одиниць оптичної густини.
З метою пітримання рекомендованих умов проведення аналізу в лабораторії необхідно мати наступне обладнання:
– повітряний термостат, що підтримує температуру +37°С±1°С, який не передбачує струшування планшета;
– пристрій для струшування планшетів (шейкер), що підтримує кімнатну температуру (+18…+25°С) та температуру +37°С±1°С. Рекомендована інтенсивність струшування складає 300-800 об/хв. Крім того, деякі набори передбачають тільки інкубацію за кімнатної температури (+18…+25°С) без струшування, у такому випадку додаткове обладнання (термошейкер) не потрібне.
– дозатори зі змінними наконечниками, які дозволяють відбирати об’єми рідини в діапазоні від 5,0 мкл до 1,0 мкл;
– дозатори зі змінними наконечниками, які дозволяють відбирати об’єми рідини до 250 мкл чи прилад для промивання планшетів;
– мірний циліндр на 500 мл;
– вода дистильована або деіонізована;
– папір для фільтрування.
Уважно ознайомтесь з Інструкціями із застосування наборів, з якими будуть працювати співробітники лабораторій для створення необхідного мінімуму обладнання.
Примітка. Восьмиканальний дозатор також рекомендовано використовувати для одночасного внесення реагентів у лунки планшета (ІФА-Буфера, кон’югата, розчину субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) та стоп-реагенту).
Як підготувати ІФА набір до аналізу?
Перед проведенням аналізу компоненти ІФА набору необхідно витримати за кімнатної температури (+18…+25°С) не менше 30 хвилин.
Упаковку планшета необхідно розкрити тільки по закінченню вказаного часу, інакше на охолодженій поверхні лунок буде конденсуватися волога, що може призвести до псування набору.
Яку кількість незалежних експериментів можна провести з використанням одного набору?
Рекомендована кількість незалежних серій експериментів не більше чотирьох.
Що свідчить про можливе псування компонентів ІФА набору?
Такими ознаками є:
· наявність видимих пошкоджень нерозпакованої упаковки з планшетом та флаконів з реагентами, калібрувальними пробами та контрольною сироваткою;
· наявність у розчинах осаду, зважених часток, плісняви;
· невідповідне опису забарвлення реагентів, в тому числі розчину субстрату тетраметилбензидину (ТМБ).
Такі компоненти не можна використовувати для проведення аналізу.
Перед початком роботи необхідно впевнитися, що всі компоненти ІФА набору по візуальним характеристикам відповідають опису, приведеному в Інструкції із застосування.
Як необхідно зберігати флакон з розчином стоп-реагенту після першого відкриття?
Флакон зі стоп-реагентом після першого відкриття необхідно зберігати за температури +2…+8°С продовж всього терміну придатності Набору. При зміні забарвлення стоп-реагенту його використання не рекомендовано.
Як необхідно зберігати розчин субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) після першого відкриття?
Флакон з розчином субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) після першого відкриття необхідно одразу після використання щільно закрити та зберігати за температури +2…+8°С продовж всього терміну придатності набору.
Категорично забороняється заморожувати розчин субстрату тетраметилбензидину (ТМБ).
При зберіганні на світлі, а також при забруднені розчину субстрату тетраметилбензидину (ТМБ) залишками крові, окисниками чи іонами металів може спостерігатися його мимовільне забарвлення в синій чи блакитний колір. Такий реагент не можна використовувати для проведення аналізів через підвищення фону при спектрофотометрії, зниження чутливості та діапазону визначених концентрацій аналіту.
Як необхідно зберігати флакон з кон’югатом після першого відкриття?
Після першого відкриття флакон з кон’югатом необхідно зберігати за температури +2…+8°С не довше 2 місяців.
Категорично забороняється заморожувати кон’югат. Це призведе до його псування.
Як необхідно зберігати концентрат розчину для відмивання та готовий розчин для відмивання?
Флакон з концентратом розчину для відмивання після першого відкриття необхідно зберігати за температури +2…+8°С продовж усього терміну зберігання набору. Готовий розчин для відмивання необхідно зберігати за кімнатної температури (+18…+25°С) не довше 5 діб або за температури +2…+8°С не довше 14 діб.
Як необхідно зберігати флакони з калібрувальними пробами та контрольною сироваткою після першого відкриття?
Калібрувальні проби та контрольну сироватку після відкриття флаконів необхідно зберігати за температури +2…+8°С не довше 2 місяців.
Категорично забороняється заморожувати калібрувальні проби та контрольну сироватку, якщо цього не прописано в Інструкції із застосування Набору. Це призведе до їх незворотного псування.
Як необхідно зберігати невикористані стрипи планшета?
Невикористані стрипи необхідно помістити назад до пакету з силікагелем та щільно закрити на замок zip-lock, якщо такий замок відсутній, ретельно заклеїти плівкою для заклеювання планшета, яка входить до набору, та помістити в оригінальну упаковку з осушувачем-силікагелем.
Категорично забороняється заморожувати планшет. Це стосується як планшета в оригінальній упаковці під вакуумом, так і планшета після першого відкриття.
За якої температури необхідно зберігати ІФА набір?
ІФА набір необхідно зберігати за температури +2…+8°С до закінчення терміну придатності, вказаного на упаковці і в Паспорті контролю якості. Дозволяється одноразове нетривале підвищення температури зберігання (транспортування) до +25°С не довше 5 діб.
Особливо важливо забезпечити правильне зберігання планшета якщо в холодильнику спостерігаються значні коливання температури (наприклад, при перенавантаженні), це може привести до утворення конденсату в лунках та нерівномірному прогріванні планшета, що дуже небезпечно для його стабільної роботи.
Категорично забороняється заморожувати та піддавати впливу високих температур весь ІФА набір.
Як правильно визначити термін придатності ІФА набору?
Термін придатності нерозпакованого ІФА набору складає 18 місяців з дати виробництва, за умови дотриманні рекомендованих умов транспортування та зберігання.
«Нерозпакований набір» означає, що кришки флаконів не відкривали, а планшети знаходяться під вакуумом (упаковка щільно прилягає до планшета).
Термін сталої роботи набору після першого відкриття в тих самих умовах складає 2 місяці від дня розкриття і в основному обмежений терміном придатності калібрувальних проб та контрольної сироватки. Більш короткий термін зберігання є загальним правилом для усіх розпакованих ІФА наборів. Це пов’язано з тим, що при проведені аналізів у флакони з реагентами можуть потрапити сторонні речовини, які не дивлячись на наявність консервантів, можуть викликати мікробну чи біохімічну деградацію їх вмісту.
З метою раціонального використання наборів після першого відкриття, що рідко використовуються, дозволяється одноразове заморожування та розморожування калібрувальних проб та контрольної сироватки в аліквотах, про що обов’язково прописано в Інструкції із застосування.