Контроль якості імуноферментного аналізу

Матеріал для дослідження методом ІФА

Матеріалом для імунологічних досліджень можуть бути різні біологічні рідини: сироватка; плазма крові; сеча; спинномозкова рідина; амніотична рідина; слина та ін.

Фактори, що впливають на результати

• Вік може впливати на концентрації аналітів у крові та сечі в період одразу після народження, в пубертатний період та у старості. 
• Раса. Вміст аналітів від расової приналежності. Суттєві відмінності в активності амілази виявлені між корінними жителями Західної Індії та корінними британцями. Виходячи із загальноприйнятого порогового значення, 50% уродженців Західної Індії мали підвищену активність амілази.
• Стать. Як і щодо зовнішнього вигляду та специфічних для кожної статі гормональних рівнів, відмінності можуть бути виявлені і в клініко-хімічних та гематологічних показниках.
• Вагітність. Трактуючи результати лабораторних досліджень у вагітних необхідно враховувати термін вагітності в момент забору проби. При фізіологічній вагітності середній об’єм плазми зростає приблизно від 2600 мл до 3900 мл, до того ж в перші 10 тижнів приріст може бути незначним, а потім відбувається зростаюче збільшення обсягу до 35 тижня, коли досягається зазначений рівень. Добре відомі властиві вагітності зміни вироблення та концентрації у плазмі статевих гормонів супроводжуються змінами різних аналітів, наприклад тироїдних гормонів, метаболітів, електролітів, білків та деяких діагностично важливих ліпідів, ферментів, факторів згортання та компонентів фібринолітичної системи.

Зміна фізичного стану

• Дієта та споживання рідини є основними факторами, що впливають на велику кількість аналітів у клінічній хімії.
• Голодування. Тривале голодування тісно пов’язане зі зниженням витрат енергії і, як наслідок, у сироватці знижені концентрації Т4 і в ще більшій мірі ТЗ.
• Фізичні вправи. Слід виділити 2 типи вправ. При вправах першого типу – статичних або ізометричних вправах короткої тривалості та високої інтенсивності – використовується енергія, вже збережена в м’язах (АТФ, креатинфосфат). При вправах другого типу – динамічних або ізотонічних вправах малої інтенсивності і великої тривалості (наприклад, біг, плавання, їзда на велосипеді) використовується АТФ, утворений аеробним або анаеробним шляхом. Крім того, необхідно враховувати вплив фізичної тренованості та м’язової маси. Швидко виникаючі зміни аналітів під час вправ, зумовлені зсувами об’ємів рідини між внутрішньосудинним та інтерстиціальним просторами, втратою рідини у зв’язку з потовиділенням та зміною концентрації гормонів (наприклад, підвищення концентрацій адреналіну, норадреналіну, глюкагону, СТГ, кортизолу, АКТГ та зниження концентрації інсуліну).
• Висота над рівнем моря. Вміст деяких компонентів крові схильний до значних змін в залежності від висоти над рівнем моря. Зі збільшенням висоти значне підвищення спостерігається щодо, наприклад, С-реактивного білка (до 65% на висоті 3600 м), 32-глобуліну в сироватці (до 43% на висоті 5400 м), гематокриту та гемоглобіну (до 8% на висоті 1400 м) і сечової кислоти. Адаптація до висоти займає тижні, а повернення до значень на рівні моря відбувається протягом декількох днів. Значне зниження величин зі збільшенням висоти над рівнем моря виявлено у відношенні  сечового креатиніну, кліренса креатиніну, естріола (до 50% на висоті 4200 м), осмоляльності сироватки, реніну плазми та трансферину сироватки.

Стимулятори та препарати, що викликають залежність в якості впливаючих факторів біологічного характеру.

• Кофеїн міститься в багатьох компонентах повсякденної їжі. Незважаючи на його широке поширення, вплив кофеїну на різні клініко-хімічні аналіти детально не досліджено. Через 3 години після прийому 250 мг кофеїну підвищується активність реніну плазми та концентрація катехоламінів. Отже, при дослідженні даних аналітів споживання кофеїну має враховуватися.
• Вплив куріння. Куріння спричиняє безліч гострих і хронічних змін концентрацій аналітів, причому хронічні ефекти швидше помірні. Куріння підвищує концентрації в плазмі або сироватці жирних кислот, адреналіну, вільного гліцерину, альдостерону та кортизолу. Ці зміни спостерігаються у межах 1 години при курінні 1-5 сигарет.
• Алкоголь. Вживання алкоголю залежно від його тривалості і ступеня може впливати на велику кількість аналітів. Ці зміни частково використовуються для діагностики та терапевтичного моніторингу. Серед обумовлених алкоголем змін слід виокремлювати гострі та хронічні зміни.

Забір  зразків

• Вплив циркадного ритму.

Деякі аналіти виявляють тенденцію до коливань їхньої концентрації у плазмі протягом доби. Ритм кортизолу є причиною недостовірних результатів тесту на толерантність до глюкози, проведеного в другій половині дня. З цієї причини референтні інтервали зазвичай встановлюють при дослідженнях між 7 і 9 годинами ранку. На циркадному ритмі можуть позначатися впливи індивідуальних ритмів – їжі, сну, фізичної активності. Ці впливи не варто плутати зі справжніми циркадними коливаннями. У деяких випадках необхідно враховувати сезонні впливи. Так, вміст трийодтироніну (Т3) на 20% нижчий влітку, ніж взимку, тоді як 25-ОН-холекальциферол виявляється в більшій концентрації влітку.

• Аналіти можуть змінюватися протягом менструального циклу.

Статистично значущі зміни аналітів можуть бути спричинені коливаннями рівнів гормонів під час менструації. Так, концентрація альдостерону в плазмі визначається вдвічі вищою перед овуляцією, ніж у фолікулярній фазі.

Подібним чином, ренін може проявити преовуляторне підвищення.

• Вплив ліків. 

На даний момент близько 30% людей, а в старших вікових групах значно більше, постійно протягом місяців і навіть років приймають певні лікарські препарати. Хімічні речовини, що входять до них і продукти перетворення, що утворюються, постійно містяться в крові людини. Під час біохімічних аналізів вони можуть вступати у взаємодію з використовуваними реактивами, спотворювати хід реакції і призводити до завищення або заниження істинного результату (хімічна інтерференція). Якщо препарат, що приймається постійно не можна скасувати на декілька днів (з урахуванням часу розпаду і виведення), то це необхідно врахувати при трактуванні результатів.

• Вибір часу по відношенню до діагностичних і лікувальних процедур. 

Багато діагностичних процедур здатні впливати на результати лабораторних досліджень. 

Під час підготовки обстежуваних до проведення біохімічних досліджень мають бути прийняті наступні підходи:

– ліки, що заважають визначенню компонентів, виключають до взяття біоматеріалу, якщо вони даються не за життєвими показаннями;

– ранковий прийом ліків проводять тільки після взяття біоматеріалу;

– взяття крові з діагностичною метою проводиться до проведення інфузії ліків і розчинів.

Сироватка

Сироватку отримують із цільної крові, що спонтанно згорнулася. Вона не містить факторів згортання крові, за винятком кальцію. Під час отримання сироватки в скляних центрифужних пробірках об’єм її становить приблизно 1/3 взятого об’єму крові. Але при деяких патологічних станах він може бути меншим. У нормальній крові згусток утворюється за кімнатної температури протягом 20-60 хв. Якщо не дотримуватися часу, то може мати місце латентне (запізніле) згортання, внаслідок якого (особливо при використанні аналізаторів) відбувається закупорка проточних елементів згустками і ускладнюється піпетування проб. У пробірках із пластику час згортання подовжується.

Плазма

Плазму отримують із крові шляхом відділення клітин. На противагу сироватці вона містить фактори згортання крові і є частиною крові, одержуваної при центрифугуванні крові, згортання якої інгібовано додаванням антикоагулянтів. Плазма і сироватка містять приблизно 93% води, а цільна кров близько 81%. У зв’язку з цим концентрація компонентів у плазмі на 12% вища, ніж в цільній крові.

Підготовка та використання компонентів набору. Режим зберігання.

Поширеною помилкою є неправильна підготовка та використання компонентів набору, а також порушення режиму його зберігання.

Рекомендації:

1. Не використовуйте реагенти після закінчення терміну придатності.
2. У випадку часткового використання зберігати реагенти відповідно до рекомендацій наведених у інструкції із застосування залежно від типу набору.
3. Не змішуйте реагенти з наборів різних серій.
4. Перед початком роботи всі реагенти мають досягти кімнатної температури. При частковому використанні набору необхідно скоротити до мінімуму перебування розчинів за кімнатної температури, особливо, у відкритому вигляді.
5. Для розчинення ліофілізованих компонентів, а також для приготування робочих розчинів з концентрованих препаратів, що входять до складу набору, необхідно використовувати дистильовану (або деіонізовану) воду зі значенням рН, близьким до нейтрального (не менше 6,0). Ліофілізовані компоненти мають бути розчинені не менше, ніж за 10-15 хв до використання, отриманий розчин ретельно перемішують – не менше 10 разів.
6. Перед використанням ретельно перемішати реагенти у флаконах. Відбирайте з флакона тільки необхідну кількість реагентів. Ніколи не зливайте надлишки реагентів назад у флакони, щоб уникнути контамінації. Закривайте кожен флакон своєю кришкою.
7. Перед розкриттям пакета з планшетом його необхідно витримати за кімнатної температури приблизно 30 хв для запобігання конденсації вологи на планшеті. Якщо планшет розбірний, і використовуються не всі стрипи одразу, то після розкриття решту стрипів необхідно негайно помістити в пакет із осушувачем і щільно його закрити.
8. Для приготування розчинів використовуйте тільки ретельно вимитий (краще одноразовий) посуд.
9. Уникайте потрапляння світла на розчин хромогену та кон’югату.
10. Робочі розчини кон’югату і субстрату зазвичай готуються за 10-15 хв до внесення у планшет (якщо немає особливих вказівок в інструкції до набору реагентів) у кількості, необхідній для аналізу.

Практичні поради щодо постановки ІФА

1. Складіть схему розташування бланка, стандартів, контролів і зразків на планшеті. Переконайтеся, що всі необхідні реагенти та зразки нагрілися до кімнатної температури.
2. Якщо допущено помилку при внесенні аналізованих зразків (наприклад, 2 зразки внесені в одну лунку), не можна, видаливши сироватку з цієї лунки, вносити у неї новий зразок.
3. Кожен із досліджуваних зразків необхідно вносити, використовуючи новий наконечник для піпетки.
4. Слідкуйте за точністю піпетування. Щоб звести до мінімуму можливі варіації через різний час інкубації, вносьте реагенти з однією і тією ж швидкістю.
5. Оптимізуйте промивання та режим роботи з мікропланшетом. Занадто інтенсивне видалення рідини вошером може підсушити білкове покриття в лунці, інактивувавши його, а занадто слабке призведе до того, що залишаться крапельки рідини. Не залишайте лунки сухими між стадіями додавання реагентів. Якщо під час роботи виникли непередбачені затримки, заповніть лунки розчином для промивання.
6. Рекомендується, щоб усі зразки аналізувалися у дублях.
7. Однією з причин отримання незадовільних результатів при використанні твердофазних наборів є використання шейкерів-інкубаторів, які не забезпечують необхідну інтенсивність струшування.
8. Температурний режим інкубації також є фактором, що впливає на перебіг імунохімічної реакції в лунці. Низька температура у лабораторії (менше 18 °C) призводить до того самого результату, що й погане струшування.
9. Під час інкубації необхідно заклеїти мікропланшет адгезивною плівкою або закрити кришкою, за винятком стадії інкубації із субстратом (тільки за допомогою кришки!).
10. Інкубуйте планшети з субстратом у темряві, так Ви зможете уникнути крайових ефектів на планшеті.
11. Регулярно перевіряйте точність роботи Вашого обладнання.
12. Необхідна наявність постійно діючої внутрішньолабораторної системи контролю якості аналізів та участь лабораторії в системі зовнішнього контролю якості аналізів.
13. Для лабораторій з невеликим обсягом досліджень важливо, щоб після розкриття набору його компоненти залишалися стабільними тривалий час. Необхідно враховувати, що, як правило, після розкриття набір стабільний не більше 1-2 місяців.